Optimización de marcadores moleculares RAPF-PCR para la caracterización de la tortuga cabezona Caretta Caretta (Testudines: Cheloniidae)

Abstract

Este estudio evaluó y estandarizó la sensibilidad, especificidad y reproducibilidad de los Polimorfismos de ADN Amplificados al Azar por la Reacción en Cadena de la Polimerasa (RAPD-PCR), con el fin de obtener marcadores genético-moleculares que permitan estimar la diversidad genética de la tortuga cabezona. Se aisló ADN de C. caretta de 2 zonas del Caribe colombiano (Don Diego N=5 e Islas del Rosario N=3) y se cuantificó obteniendo entre 8.63-78.5 ng/?l. Se aplicó una matriz ortogonal de Taguchi que permitió reducir de 81 a 9 el número de reacciones. Las mejores condiciones de la reacción se determinaron evaluando concentraciones de 0.59 a 7.85 ng de ADN, 2 a 4 mM de MgCl2, 1 a 6 Unidades de Taq ADN polimerasa y de 0.1 a 0.5 ?M de oligonucleótidos. Las condiciones estandarizadas se dieron con 7.85 ng/?l de ADN, 3.5 mM de MgCl2, 200 mM de dNTPþs, 0.5 ?M de oligonucleótido y una unidad de Taq ADN Polimerasa, en un volumen de reacción de 20 ?l. Las condiciones de termociclado de la reacción se iniciaron con una desnaturalización a 94°C por 5 m, seguida por 40 ciclos de: 94°C por 40 s, 37°C por 40 s y 72°C por 90 s y una fase de elongación final de 72°C por 5 m. La diversidad genética se determinó utilizando el índice de Shannon obteniendo valores entre 2.19-2.48 para los individuos de Don Diego y entre 0.39-1.38 para los de Isla del Rosario. El índice de Pielou, produjo valores cercanos o iguales a 1. Se estandarizó una metodología que produce bandas claras, legibles y reproducibles, condiciones indispensables para que esta técnica de RAPD pueda utilizarse como alternativa confiable para realizar estudios de diversidad genética en la tortuga cabezona.